BOD5測定通常采用標準稀釋與接種法(GB 7488--87)，其操作為，經中和及除去毒性物質并經稀釋后的水樣(必要時加入適量含好氧微生物的接種液)置入培養瓶中，于在20oC暗處培養5d，通過分別測定培養前后水樣中溶解氧的含量，來計算出5d內的耗氧量，再根據稀釋倍數求得其BOD5。
BOD5的測定是生物作用和化學作用的共同結果，必須嚴格按照操作規范進行，變更任何一個條件，都將影響測定結果的準確性和可比性。影響BOD5測定的條件包括pH值、溫度、微生物種類和數量、無機鹽含量、溶解氧和稀釋倍數等。
化驗BOD5的水樣必須充滿并密封于取樣瓶中，在2～5oC的冷藏箱內保存到分析時。一般應在采樣后6h內進行檢驗，在任何情況下，水樣的貯存時間不能超過24h。
測定工業廢水的BOD5時，由于工業廢水通常溶解氧含量較少而且成分多為可生化降解的有機物，為保持培養瓶內的好氧狀態，必須將水樣稀釋(或接種稀釋)，這一操作是標準稀釋法的最大特征。為確保測得結果的可靠性，對于稀釋后的水樣培養5d的耗氧量必須大于2mg/L，殘留溶解氧必須大于1mg/L。
投入接種液是為了保證有一定量的微生物降解水中的有機物，接種液的量以使5日耗氧0.1mg/L以下為佳。使用由金屬蒸餾器制備的蒸餾水作為稀釋水時，應注意檢查其中的金屬離子含量，以避免因此抑制微生物繁殖和代謝。為確保稀釋水中溶解氧接近飽和，必要時可通入凈化空氣或純氧，然后于在20oC培養箱中放置一定時間，使之與空氣中氧分壓達到平衡。
稀釋倍數的確定是以培養5日耗氧大于2mg/L，剩余溶解氧大于1mg/L為原則。稀釋倍數過大或過小，都會導致檢驗失敗。而且由于BOD5分析周期較長，一旦出現類似情況，就無法以原樣補測。初測某一工業廢水的BOD5時，可以首先測定其CODCr，然后查閱參考已有的水質類似的廢水的有關監測數據，初步確定待測水樣BOD5/CODCr值，據此推算出BOD5的大致范圍和確定稀釋倍數。
對含有抑制或殺滅好氧微生物代謝活動的物質的水樣，直接用通常方法測定BOD5的結果會偏離實際值，必須在測定前做相應的預處理，這些對BOD5測定有影響的物質和因素包括重金屬及其他有毒的無機物或有機物、余氯等氧化性物質、pH值過高或過低等。
